Detekcija nukleinske kiseline virusa

Poznate su genomske sekvence većine virusa.Sonde nukleinske kiseline koje su kratki segmenti DNK dizajnirani da se hibridiziraju s komplementarnim virusnim DNK ili RNA segmentima.Lančana reakcija polimeraze (PCR) je efikasnija tehnika za otkrivanje virusa.Nedavno su razvijene dijagnostičke metode visoke propusnosti.

A. Tehnika hibridizacije nukleinske kiseline

Hibridizacija nukleinske kiseline, uglavnom uključujući Southern blotting (Southern) i Northern blotting (Northern), je nova tehnika koja se brzo razvija u polju dijagnostike virusa.Obrazloženje testa hibridizacije je korištenje kratkih segmenata DNK (zvanih “sonda”) dizajniranih za hibridizaciju s komplementarnim virusnim DNK ili RNK segmentima.Zagrijavanjem ili alkalnom obradom, dvolančana ciljna DNK ili RNK se razdvajaju u jednostruke niti, a zatim se imobiliziraju na čvrstoj podlozi.Nakon toga se dodaje sonda i hibridizira sa ciljnom DNK ili RNK.Kako je sonda označena izotopom ili neradioaktivnim nuklidom, ciljna DNK ili RNK se mogu otkriti putem autoradiografije ili pomoću sistema biotin-avidin.Budući da je većina virusnih genoma klonirana i sekvencionirana, mogu se otkriti korištenjem sekvenci specifičnih za virus kao sondi u uzorku.Trenutno, metode hibridizacije uključuju: dot blot, in situ hibridizaciju u ćelijama, DNK blot (DNK) (Southern blot) i RNA blot (RNA) (Northern blot).

B.PCR tehnologija

Posljednjih godina razvijena je serija in vitro tehnika amplifikacije nukleinske kiseline zasnovane na PCR-u, za testiranje neosjetljivih ili nekulturnih virusa.PCR je metoda koja može sintetizirati specifičnu sekvencu DNK reakcijom in vitro polimeraze.Proces PCR-a uključuje termički ciklus od tri koraka: denaturacija, žarenje i ekstenzija Na visokoj temperaturi (93℃~95℃), dvolančana DNK se razdvaja u dva jednostruka DNK lanca;zatim na niskoj temperaturi (37℃~60℃), dva sintetizovana nukleotidna prajmera spajaju komplementarne DNK segmente;dok na odgovarajućoj temperaturi za Taq enzim (72℃), sinteza novih lanaca DNK počinje od 3' kraja prajmera koristeći komplementarnu DNK kao šablone i pojedinačne nukleotide kao materijale.Dakle, nakon svakog ciklusa, jedan lanac DNK može biti amplificiran u dva lanca.Ponavljajući ovaj proces, svaki DNK lanac sintetiziran u jednom ciklusu može se koristiti kao šablon u sljedećem ciklusu, a broj DNK lanaca se udvostručuje u svakom ciklusu, što znači da se proizvodnja PCR-a pojačava brzinom od 2n log.Nakon 25 do 30 ciklusa, proizvodnja PCR-a se identifikuje putem elektroforeze, a specifični DNK proizvodi se mogu posmatrati pod UV svjetlom (254nm).Zbog svoje prednosti u pogledu specifičnosti, osjetljivosti i praktičnosti, PCR je usvojen u kliničkoj dijagnostici mnogih virusnih infekcija kao što su HCV, HIV, CMV i HPV.Kako je PCR vrlo osjetljiv, može otkriti DNK virusa na nivou fg, operaciju treba izvesti vrlo pažljivo kako bi se izbjeglo lažno pozitivno.Osim toga, pozitivan rezultat testa na nukleinsku kiselinu ne znači da u uzorku ima živog infektivnog virusa.

Uz široku primjenu PCR tehnike, razvijaju se nove tehnike i metode zasnovane na PCR tehnici za različite svrhe testiranja.Na primjer, kvantitativni PCR u realnom vremenu može otkriti virusno opterećenje;in situ PCR se koristi za identifikaciju virusne infekcije u tkivu ili ćelijama;Ugniježđeni PCR može povećati specifičnost PCR-a.Među njima, kvantitativni PCR u realnom vremenu se brže razvija.Mnoge nove tehnike, kao što su TaqMan hidrolizna sonda, hibridizacijska sonda i molekularna beacon sonda, kombinovane su u kvantitativnu PCR tehniku ​​u realnom vremenu, koja se široko koristi u kliničkim istraživanjima.Osim preciznog utvrđivanja virusnog opterećenja u tjelesnoj tekućini pacijenata, ova metoda se također može koristiti za otkrivanje mutanta tolerantnog na lijekove.Stoga se kvantitativni PCR u realnom vremenu uglavnom primjenjuje u evaluaciji kurativnog efekta i nadzoru tolerancije na lijekove.

C. Visoko propusna detekcija virusnih nukleinskih kiselina

Kako bi se zadovoljile potrebe za brzom dijagnostikom novih emergentnih zaraznih bolesti, uspostavljene su različite visokopropusne metode detekcije, poput DNK čipova (DNK).Za DNK čipove, specifične sonde se sintetiziraju i vezuju za male silikonske čipove vrlo visoke gustine kako bi se formirao mikroniz DNK sonde (DNK) koji se može hibridizirati s uzorkom.Signal hibridizacije može se snimiti konfokalnim mikroskopom ili laserskim skenerom i dalje kompjuterski obraditi i može se dobiti ogroman skup podataka o različitim genima.Postoje dvije vrste DNK čipa.„Čip za sintezu“ je sljedeći: specifični oligonukleotidi se sintetiziraju direktno na čipovima.Drugi je čip DNK bazena.Klonirani geni ili PCR proizvodi su uredno odštampani na stakalcu.Prednost tehnologije DNK čipa je istovremeno otkrivanje velike količine DNK sekvenci.Najnovija verzija čipa za otkrivanje patogena može identificirati više od 1700 ljudskih virusa odjednom.Tehnologija DNK čipa riješila je probleme tradicionalnih metoda hibridizacije nukleinskih kiselina i ima vrlo široku primjenu u virusnoj dijagnostici i epidemiološkim studijama.